IHC雙標記染色(DOUBLE STAIN)

描述

Double Stain染色步驟(protocol)
1.   烤片65度C，60分鐘。
2.   脫蠟，Xylene*2，各10分鐘。(或Xylene*3，各7分鐘。)
3.   覆水，100%*2、95%*1、85%*1、75%*1，各2分鐘。
4.   PBS 浸泡。
5.   De-peroxidase reagent，室溫20分鐘。
6.   PBS wash*3。
7.   Antigen Retrieval:
電鍋法:將已稀釋的Citrate buffer pH6 約200ml，以電鍋隔水加熱15分鐘後預溫，將已覆水之玻片置入緩衝液中，以電鍋加熱20分鐘。靜置降溫後再進行染色。
8.   PSB wash*3。
9.   Immunoblock，室溫60分鐘。
10. PBS wash*3。
11. 第一支Primary antibody，室溫反應60分鐘。
12. PSB wash。
13. PolyDetector，30分鐘。
14. PSB wash*3。
15. DAB brown，1~10分鐘(30ul DAB + 1ml DAB buffer)，依實驗需求調整呈色時間。
16. De-peroxidase reagent，室溫20分鐘。
17. PBS wash*3。
18. Immunoblock，室溫 overnight。
19. 第二支Primary antibody，反應時間依抗體抓條件。
20. PBS wash*3。
21. PolyDetector，30分鐘。
22. PBS wash*3。
23. HRP Green呈色，依實驗需求調整呈色時間。
24. Hematoxylin，15秒。
25. Running water wash，兩分鐘。
26. 風乾後封片。