微粒子計數器

美國TSI AEROTRAK™微粒子計數器,符合ISO 21501-4的嚴格規定。 這些粒子計數器採用PSLs校正,追溯NIST,是公認的標準粒子測量。

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免疫組織化學染色試劑

有效解決non-specific binding造成的Background。
可用於2種物種來源相同的抗體進行染色。
經濟實惠,且可避免Ms on Ms,Rb on Rb 干擾。

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組織包埋、切片、染色、判讀掃片

應用於藥物開發、健康食品功能性,或研究單位探討疾病時透過不同動物模型加以實驗評估;對實驗動物全身組織器官全面性檢查或細部分析,以瞭解藥物與食品的毒性或功效。

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免疫組織化學染色相關問題


免疫組織化學染色(Immunohistochemistry, IHC)染色問題

 

客戶對於結果的常見問題

 

一、 產生組織切片非特異性染色的原因有哪些? 如何解決?

1 、 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。 這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。 這是最重要的一條。

2 、 一抗用多株抗體易出現非特異性著色,建議試用單株抗體看看。

3 、內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含紅血球較多的組織),需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色。

4 、非特異性組分與抗體結合,這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果。

5 、 DAB 孵育時間過長或濃度過高。

6 、 PBS 沖洗不充分,殘留抗體結果增強著色,在一抗 / 二抗 /SP 孵育後的浸洗尤為重要。

7 、 標本染色過程中經常出現乾片,這容易增強非特異性著色。

 

二、免疫組織化學染色呈陰性結果的原因有哪些?

1 、抗體濃度和品質問題以及抗體來源選擇錯誤。 不是抗體濃度越高就越易出現陽性結果,抗原抗體反應有前帶和後帶效應,必須測試最佳濃度。

2 、抗原修復不全,對於甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位,以利於與抗體結合;建議微波修復 用高火 4 次 *6min 試試。 有人做過實驗,這是最佳的時間和次數。 若不行,還可高壓修復,或是電鍋修復(陽春實用的方法)。

3 、組織切片本身這種抗原含量低。

4 、血清封閉時間過長。

5 、DAB 孵育時間過短。

6 、細胞通透不全,抗體未能充分進入胞內參與反應。

7 、開始做免疫組化,建議一定要首先做個陽性對照片,排除抗體等問題。

 

三、石蠟切片和冷凍切片的比較?

1 、要求做冷凍切片的不一定能做石蠟切片。 因為做石蠟切片時要高溫烤片,可能會破壞組織的抗原性,如果組織的抗原性較穩定,則可作石蠟切片;但是要求做石蠟切片的,可作冷凍切片。

2 、冷凍切片的優點是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性,做免疫組化時不需抗原修復這一步。 缺點是細胞內易形成冰晶而破壞細胞結構,可能會使抗原彌散;切片厚度較石蠟的厚,做的片子沒石蠟的漂亮。 當你買一抗時,目錄上都寫著做什麼樣的切片,如果它寫著只能做冷凍,就不能做石蠟,如寫著兩者都可,那就都能做。

3、石蠟切片的優點可以保持組織細胞的形態結構,且容易存放在室溫,而冷凍切片比較麻煩,一定要存在-80 度的低溫冰箱中,尤其是用來做原位雜交的的切片,為了防止 RNA 降解,保存一貫很重要。

4、石蠟製作的切片,可以製成極薄的切片,一般的切片厚度要求在3-5微米,而石蠟切片不但可 以達到這個要求,甚至可以切得更薄到2微米以 至1微米,所以原位雜交探針容易滲透到組織中去,容易成功,而且得到的顏色/形態都較冷凍切片好。

 

四、如何選擇一抗?

1 、單株和多株抗體的選擇。 由一種克隆產生的特異性抗體叫做單株抗體。 單株抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定位結合,就像導彈精確地命中目標一樣。 另一方面,即使是同一個抗原決定位,在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體,形成好幾種單株抗體混雜物,稱為多株抗體。 在抗原抗體反應中,一般單株抗體特異性強,但親和力相對小,檢測抗原靈敏度相對就低;而多株抗體特異性稍弱,但抗體的親和力強,靈敏度高, 但易出現非特異性染色(可以通過封閉等避免)。

2 、應用範圍的選擇。 有的一抗只能用於 Western blotting,或免疫組化、免疫螢光、免疫沉澱等;甚至標明石蠟切片或冷凍切片。

3 、種屬反應性的選擇( species reactivity )。 這一點很重要,表明這種抗體可能存在種屬差異,且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內的抗原。

4 、種屬來源,一般兔來源的多是多株抗體;而小鼠來源的多是單株抗體,但也有另外。 根據此來源來選擇相應的二抗。

5 、供應商的選擇。

 

五、封閉血清(Blocking buffer)的選擇原則是什麼?

1 、膜上或切片上有剩餘的位點可以非特異性吸附抗體,造成後續結果的假陽性。

2 、封閉血清一般是和二抗同一來源的,血清中動物自身的抗體,預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合,否則在後面的步驟中如果和二抗發生結合,會造成背景。

3 、可以用小牛血清、 BSA 、羊血清等,但不能與一抗來源一致。

4、可用BioTnA Immunoblock 有效降低Background,避免non-specific binding干擾。

 

六、抗體孵育條件的比較?

1 、一抗孵育溫度有幾種: 4 度、室溫、 37 度,其中 4 度效果最佳;孵育時間:這與溫度、抗體濃度有關,一般 37 度 1-2h , 4 度過夜(從冰箱拿出後 37 度複溫 45min )。

2 、二抗一般室溫或 37 度 30min-1hr ,具體時間需要摸索。

 

七、 DAB 顯色時間如何把握?

1 、 DAB 顯色時間不是固定的,主要由顯微鏡下控制顯色時間,到出現淺棕色本底時即可沖洗。

2 、 DAB 顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就出現很深的棕褐色,這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間 過長,需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間。

3 、此外,若很短時間就出現背景很深,還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全,需要延長封閉時間。

4 、 DAB 顯色時間很長(如超過十幾分鐘)才出現陽性染色,一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短(最 好一抗 4 度過夜);另一方面就是封閉時間過長。

 

八、為什麼要做抗原修復(Antigen retrieval) ? 有哪些方法?

1 、由於組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中,發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用,從而失去抗原性。 通過抗原修復,使得細胞內抗原決定族重新暴露,提高抗原檢測率。

2 、修復方法從強到弱一般分為三種,高壓修復、微波修復、酶修復。 修復液也分為兩種(具體的可以查閱相關資料,根據條件修復液PH值不同)。

 

九、為什麼要去除內源性的過氧化酶(De peroxidase)?

1 、為消除 Endogenous peroxidase 活性,溶解紅血球,避免 peroxidase 造成 false positive 。 3%H2O2即可,一般約10~20分鐘。

 

十、如何降低組織非特異性染色(non-specific binding)?

1 、縮短一抗 / 二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。 這是最重要的一條。

2 、一抗用多株抗體易出現非特異性著色,建議試用單株抗體看看。

3 、內源性過氧化物酶和生物素在皮膚、肝臟、腎臟等組織含量很高(含紅血球多的組織),需要通過延長時間和增加濃度來降低背景染色。

4 、非特異性組分與抗體結合,這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果。

5 、縮短 DAB 孵育時間或降低 DAB 濃度 / 過氧化氫濃度等。

6 、適當增加 PBS 沖洗次數和浸洗時間,在一抗、二抗或 SP 孵育之後的浸洗尤為重要。

7 、防止標本染色過程中出現乾片,這容易增強非特異性著色。

 

十一、背景(Background)染色較深的原因有哪些?

1 、抗體濃度過高:一抗濃度過高是常見的原因之一。 解決辦法是,每次使用新抗體前應當對其工作濃度進行測試, 使每一抗體個體化,找到適合自己實驗室的理想工作濃度,既使是即用型的抗體也應如此,不能只簡單的按說明書進行染色。

2 、抗體孵育時間過長或溫度較高:解決辦法是,嚴格執行操作規程,最好隨身佩帶報時表或報時鐘,及時提醒, 避免因遺忘而造成時間延長。 現在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的時間不是傳統的 1 小時, 而是 30 分鐘,因此,要根據染色結果進行調整。

3 、 DAB 變質和顯色時間太長: DAB 最好現用現配,如有沉渣應進行過濾後再用。 配製好的 DAB 不應存放時間太長, 因為在沒有酶的情況下,過氧化氫也會游離出氧原子與 DAB 產生反應而降低 DAB 的效力,未用完的 DAB 存放在冰箱裡幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。 DAB 的顯色最好在顯微鏡下監控,達到理想的染色程度時立即終止反應。 不過當染色片太多時或用染色機時,這樣做似乎不現實,但至少應對一些新的或少用的抗體顯色時進行監控,避免顯色時間過長。

4、組織變乾:修復液溢出後未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變乾的原因。 解決的辦法是操作要認真仔細,提高操作速度。

5 、切片在緩衝液或修復液中浸泡時間太長(大於 24 小時):原因上不清楚,但現象存在。 有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復,第二天加抗體進行免疫組化染色,如果將裝有切片和修復液的容器放在 4ºC 冰箱過夜,對結果無明顯影響 ,如果放在室溫,特別是炎熱的夏天,會出現背景著色,因此,不可存放時間太長。

6 、一抗變質、品質差的多株抗體:注意抗體的有效期,過期的抗體要馬不顯色要馬背景著色。 用新買抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

 

十二、Ms Ab on Ms tissue,Rb Ab on Rb tissue問題?

1 、由於抗體與組織來源相同,容易造成non-specific binding干擾,可以使用BioTnA的Immunoblock有效降低Background。

 

十三、可見光或螢光Double stain 為什麼Background很高?

1、有可能血清封閉液效果不佳,或者兩支抗體來源相同。可以使用BioTnA的Immunoblock即可有效降低背景。

 

十四、常用老鼠的抗體,有時候又會用兔子的抗體,一定要買兩種Poly Detector(二抗)嗎?

1、BioTnA推出for Ms/Rb probe HRP Labeling Kit可以一劑兩用,節省成本。